Apareció durante la Guerra Civil Española (1936-1939) y se le atribuye al general Mola, del bando nacionalista. Al parecer, en 1936 el citado militar, que dirigía cuatro columnas de soldados en el ataque a la ciudad de Madrid, en manos del gobierno republicano, aludió a una «Quinta Columna» formada por madrileños que actuaban contra la República Española desde territorio republicano. A partir de entonces, se hablaba de grupos de quintacolumnistas que luchaban por el triunfo nacionalista en la España republicana.
A diferencia de los partisanos, que suelen ser vistos como héroes que resisten una invasión externa en inferioridad de condiciones; el miembro de una quinta columna es visto, no siempre, como un traidor a su gente, como un colaboracionista o como un infiltrado.
Por extensión, toda aquella persona o grupo que es acusado de destruir desde dentro una organización, comunidad, grupo, etc., con el objeto de facilitar el trabajo al enemigo de éstos (Véase sabotaje).
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